Effect of High Temperature Stress on Fatty Acids in Mycelia of Lentinula edodes

Zhao Yan ^1*　Li Zhiping ^1,2*　Ren Yunfei ¹　Zhang Meiyan ¹　Song Xiaoxia ¹　Zha Lei ¹　Yang Huanling ¹　Chen Mingjie ^1**

1 Institute of Edible Fungi, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding, Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization (South), Ministry of Agriculture, P. R. China, National Engineering Research Center of Edible Fungi, Shanghai 201403; 2 College of Food Science & Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306

* These authors contributed equally to this work

** Corresponding author, mjchen@saas.sh.cn

Abstract　Lentinula edodes is a widely cultivated edible fungus, environmental factors such as high temperature can greatly affect its growth. In this study, the changes of fatty acid contents in the mycelia of L. edodes strains 18 and 18N44 were determined by GC-MS at 37 °C for different time (0, 4, 8, 12, 18, 24 h). Results showed that the fatty acid types of the two strains did not change under high temperature stress, but the total fatty acid content gradually decreased. With the extension of high temperature stress time, the proportion of major saturated fatty acid palmitic acid continued to increase, the proportion of major unsaturated fatty acid linoleic acid continued to decrease, while the saturated fatty acid ratio of heat-tolerant strain 18N44 was significantly higher than that of 18 (except for 24 h under high temperature stress). Therefore, the results of this study indicate that there is a positive correlation between the proportion of saturated fatty acids in L. edodes and its heat tolerance under high temperature, which provides a theoretical basis for the breeding of new varieties of L. edodes with high temperature tolerance.

Keywords　High temperature stress, Lentinula edodes, Mycelia, Fatty acids

香菇[Lentinula edodes (Berk.) Pegler]别名香蕈、香信等，属于担子菌门(Basidiomycota)、伞菌纲(Agaricomycetes)、伞菌目(Agaricales)，光茸菌科(Omphalotaceae)、香菇属(Lentinula)，是一种十分重要的食药用菌，在我国有着悠久的栽培历史(何永等, 2010; 王贺祥, 2014)。香菇是一种中低温菌，其菌丝最适生长温度为24~27 °C，子实体生长发育的温度为8~20 °C，高温胁迫会严重影响香菇菌丝与子实体的生长，从而造成巨大的经济损失(王贺祥, 2014; 王刚正等, 2017)。

当生物受到高温胁迫时，饱和脂肪酸含量及饱和度的增加，有利于维持细胞膜的流动性和稳定性，进而使物种能够在逆境下存活与生长(Pham Thi et al., 1990; Oberson et al., 1999; 王飞等, 2013)。在生长温度较高的环境条件下，植物可改变膜脂中饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的含量，使膜脂中不饱和度与温度呈现负相关，以此来适应高温环境(Falcone et al., 2004)；在不同种类的微生物中，其在生长温度调节下的脂肪酸合成具有相似性，如高温胁迫下黑曲霉不饱和脂肪酸占总脂肪酸的比值降低，有利于维持其膜脂的稳定性(Guerzoni et al., 2001; Tereshina et al., 2011)，而植物乳杆菌在高温条件下，可通过增加饱和脂肪酸占总脂肪酸的比例和降低脂肪酸链的双键数目来维持菌株的正常生长(Haddaji et al., 2017)。研究表明子实体与菌丝体的脂肪酸组成类似(Tang et al, 2011)，且在食用菌的研究中常用菌丝体作为试验材料。本研究中所用的香菇菌株18N44是由18通过紫外诱变而来，且其耐高温性显著优于18(王丽宁等, 2014)。因此，本文选取香菇菌株18N44和18作为试验材料，比较两个香菇菌株在37 °C高温胁迫下各自菌丝体中脂肪酸的变化情况，阐述高温胁迫与香菇脂肪酸间的关系，为今后耐高温香菇新品种的选育提供技术支撑。

1结果与分析

1.1高温胁迫后香菇菌丝的恢复生长情况

在37 °C高温处理12 h后，香菇18菌丝的生长受到了明显地抑制，25 °C下恢复后的菌丝形态也由浓密变得稀疏(图1A)；香菇18N44菌丝在37 °C高温处理12 h后，其菌丝生长虽然也受到了抑制，但经过25°C恢复生长后，其菌丝形态很快恢复到正常生长时的状态，而且恢复生长的速度要显著快于18菌株(图1B)。

1.2高温胁迫后香菇菌丝总脂肪酸及饱和脂肪酸的变化

受高温胁迫后，香菇18、18N44菌丝体脂肪酸的种类未发生改变，而含量发生了变化。虽然18与18N44的总脂肪酸含量变化趋势不一致，但两者均在4和24 h时分别达到最大值(4133.87 μg/g, 3652.97 μg/g)与最小值(3369.92 μg/g, 2587.60 μg/g)，其中在高温处理0、4、18和24 h时，18与18N44的总脂肪酸含量呈现显著性差异(图2a)。随着高温胁迫时间的延长，18与18N44的饱和脂肪酸在各自总脂肪酸中的占比均呈现先降低后上升的趋势(图2b)，其中18N44的饱和脂肪酸占总脂肪酸的比值要明显高于18，并且在高温处理、4、8、12和18 h时两者的差异达到了极显著水平(P<0.01)。

1.3高温胁迫对香菇中占总脂肪酸比值较高的六种脂肪酸的影响

在高温处理前后，香菇18、18N44菌丝体中十五碳酸(C15:0)、棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、棕榈油酸(C16:1)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2))占各自总脂肪酸的比值相对较高。随着高温胁迫时间的延长，18菌株中十五碳酸占总脂肪酸的比值基本呈缓慢上升趋势，在高温处理24 h时达到最大值1.58%，而18N44菌株在整个高温胁迫过程中，其十五碳酸占总脂肪酸的比值先升高后降低，在高温处理12 h时达到最大值1.22% (图3a)。在两个香菇菌株中，棕榈酸均是各自第一饱和脂肪酸，且除高温处理24 h外，18N44菌丝体中的棕榈酸占总脂肪酸的比值都要显著高于18，其中18N44中的棕榈酸占总脂肪酸的比值在高温处理12 h时达到最大值21.78%，18中的棕榈酸占总脂肪酸的比值在高温处理24 h时达到最大值20.78% (图3b)。高温胁迫下，硬脂酸占总脂肪酸的比值在香菇两菌株中的变化趋势并不相同，在高温处理12~24 h期间，18菌株中的硬脂酸占总脂肪酸的比值要显著高于18N44，并在高温处理18 h时达到最大值2.66% (图3c)。

在整个高温胁迫过程中，18N44菌丝体中的棕榈油酸占总脂肪酸的比值都要显著高于18，其中18N44菌株中棕榈油酸占总脂肪酸的比值分别在高温处理12 h和24 h时达到最大值和最小值(图3d)。与棕榈油酸占总脂肪酸的比值相似，在整个高温胁迫过程中，18N44中的油酸占总脂肪酸的比值始终显著高于18中的，并在高温处理24 h时达到最大值7.06% (图3e)。在所有不饱和脂肪酸中，亚油酸是两个香菇菌株中的第一不饱和脂肪酸，其占总脂肪酸的比值要远远高于棕榈油酸和油酸。在高温胁迫过程中，18菌株中的亚油酸占总脂肪酸的比值要显著高于18N44(0 h除外)，两者均在高温处理4 h时达到最大值，分别为69.26%和64.40% (图3f)。

2讨论

高温胁迫会给食用菌带来多种危害，如食用菌中生物膜被氧化、细胞膜的稳定性遭到破坏、大分子蛋白被降解等，进而影响食用菌的产量(曹现涛等, 2015)。有研究指出，高温处理会使植物中饱和脂肪酸占比升高，以此来提升其耐热能力(Beca-Carretero et al., 2018)。本研究的结果也显示：在高温胁迫过程中，香菇18和18N44菌丝体中饱和脂肪酸占比不断升高，并且在高温处理4~18 h期间，耐高温菌株18N44中的饱和脂肪酸占比显著高于不耐高温菌株18中的，表明香菇中饱和脂肪酸占比的提升有助于增强其耐热性。随着高温胁迫时间的延长，主要不饱和脂肪酸亚油酸的占比在两个菌株中均持续降低，而主要饱和脂肪酸棕榈酸的占比持续升高，高温胁迫影响了香菇菌丝内两大主要脂肪酸的占比，该结果与Guerzoni等(2001)人的研究结果一致。已有的研究表明，在高温胁迫条件下花生根瘤菌中油酸占比迅速降低，而棕榈酸与硬脂酸的占比升高，油酸占比的降低及棕榈酸与硬脂酸的占比的升高可提升其抗逆性(Paulucci et al., 2011)。棕榈酸为两个香菇菌株中第一饱和脂肪酸，受高温胁迫后其占比在两个菌株中均有所增加，且耐高温菌株18N44中棕榈酸占比显著高于不耐高温菌株18；在两个香菇菌株中油酸占比仅次于亚油酸，在高温胁迫4~12 h期间，18N44中油酸占比持续降低，而18中油酸占比则相反，且18N44中主要不饱和脂肪酸亚油酸占比显著低于18，这可能是18N44的耐高温性优于18的重要原因之一。

综上，经37 ℃高温处理后，香菇18N44菌丝恢复生长情况明显优于18。通过GC-MS测定高温胁迫下香菇菌丝中脂肪酸组成及含量变化，发现两个菌株的脂肪酸种类并未发生改变，总脂肪酸含量变化明显，基本随高温胁迫时间的延长逐渐降低。对于耐高温菌株18N44，其饱和脂肪酸占比不断升高，主要饱和脂肪酸棕榈酸的占比显著高于18中的(高温胁迫24 h除外)，而主要不饱和脂肪酸亚油酸的占比则相反，表明饱和脂肪酸占比的升高可增强香菇的耐热性。因此，本研究以耐高温性不同的两个香菇菌株18和18N44为试验材料，对两者在高温胁迫前后的脂肪酸变化情况进行了分析与比较，为耐高温香菇新品种的选育提供了一定的理论依据。

3材料与方法

3.1供试菌株

香菇菌株18和18N44均由上海市农业科学院食用菌研究所提供。

3.2液体培养基

马铃薯200 g，葡萄糖20 g，加蒸馏水到1 L，pH自然。

3.3主要仪器及试剂

主要仪器：美国安捷伦公司7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)，上海精宏实验设备有限公司DHG-9023A型烘箱，天津奥特赛恩斯仪器有限公司MTN-2800D型氮气吹干仪，上海康禾光电仪器有限公司H-101型振荡仪，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司H1650-W型离心机。

主要试剂：5% H₂SO₄，正己烷，Methyl Nonadecanoate (十九烷酸甲酯)。

3.4高温处理后香菇菌丝的恢复生长情况

将活化后的香菇菌株(18, 18N44)接种到PDA平板上，在25 °C培养箱内静置培养5 d，随后将平板在37 °C高温下处理 12 h。高温处理后的平板放置在25 °C培养箱内进行恢复生长，培养7 d后观察香菇菌丝的恢复生长情况。

3.5高温处理后香菇菌丝脂肪酸的测定

将18和18N44在PDA平板上培养14 d，转接三次后，将两菌株分别接种于装有100 mL液体培养基的三角瓶(容量为250 mL)中，然后将其置于摇床(25 °C, 150 r/min)中培养14 d，于37 °C高温下分别处理0、4、8、12、18和24 h，每个菌株的每个高温处理时间点设置3个生物学重复。收集两个菌株高温处理后的菌丝体，用于测定其脂肪酸种类及含量。

称取0.2 g菌丝，分别加入1.0 mL 5% H₂SO₄和5 μL内标到试管中，随后每10 s向试管内吹氮气用于排除空气。在80 °C下立即加热90 min，然后置于4 °C冷藏10 min后，转移至玻璃小瓶中，再加入0.5 mL超纯水和1.0 mL正己烷振荡20 s，最后在2000 rpm下离心10 min，待分层后，取上层液体于进样小瓶中进行GC-MS分析。

色谱柱：DB-5ms(30 m×0.25 mm×0.25 µm)；进样量：1.00 μL；进样温度：270 °C；分流比：5：1；载气：氦气(99.999%)；流量：1 mL/min；柱温：70 °C保持5 min，以25 °C/min升至200 °C，以2 °C/min升至240 °C，以20 °C/min升至300 °C，保持7 min；接口温度：280 °C；离子源温度：230 °C；四级杆温度：150 °C；电离方式：EI，70 eV；检测器电压：2106 V；扫描方式：全扫描；质量范围：33~500；NIST 2014谱库。

作者贡献

赵妍、李治平和任畇霏是本研究的实验设计者和试验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；张美彦、宋晓霞、查磊和杨焕玲参与实验设计和试验结果分析；陈明杰是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家食用菌产业技术体系基金(CARS20)资助。

参考文献

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